comentarisviruslents

He llegit darrerament algunes entrades a tuiter i comentaris en blogs que malparlen de la PCR en relació a SARSCoV2, sí les RCPs serien la denominació catalana, tot era per despistar un xic, amb arguments, alguns, molt peregrins. Aquí us dono quatre dades i comentaris pel que fa a aquesta tècnica, relacionades amb SARSCoV2, tal com ho veig.

Les PCRs no detecten el virus sencer?

No, la PCR és una tècnica diagnòstica en el que ha de primar la rapidesa…i l’especificitat, òbviament. El genoma dels coronavirus té 30.000 nucleòtids, no té sentit amplificar-los tots; el que ens interessa és haver identificat la presència del virus fent servir dues o tres seqüències que siguin especifiques i altament conservades (que es trobin a tots els diferents aïllaments del virus, de SARSCoV2) i no descrites en altres virus que ens permetin fer amplificacions específiques.

Podem seqüenciar el virus sencer? Sí, molt més ràpid que fa uns anys, però tot i així és un procés molt més lent que una qRT-PCR (que es podria transcriure com Transcripció Reversa-Reacció en Cadena de la Polimerasa quantitativa, o en temps real, ja hi tornarem) i quan es tracta de tenir resultats en unes hores perquè d’això depèn un confinament, una definició de contacte a aïllar, o d’un clúster aquest és el “driver”, la rapidesa. No és que no es pugui, és que no facilita la presa de decisions. I de tota manera sempre hi ha una fracció que sí es porta a seqüenciar, però sense la pressió del rellotge assistencial, per poder fer estudis de com varia el virus (si varia) a diferents zones geogràfiques, quin és l’origen, etc. Però aquests són estudis de context, no estudis executius.

Les PCRs es poden contaminar?

I tant, tothom que ha treballat en un laboratori de microbiologia, o específicament virologia, sap que les amplificacions poden portar a contaminacions; però hi ha controls, prou controls per posar-la de manifest i descartar la prova; i repetir-la; hi ha controls positius i negatius d’extracció, controls positius i negatius d’amplificació, etc. I apliquen tant a les PCRs directes, aquelles que ja parteixen de ADN, com a les “indirectes”, les RT-PCR que necessiten una etapa prèvia de conversió de ARN en ADN, una transcripció reversa o Reverse Transcription (RT, en anglès) per amplificar després aquest darrer. La transcripció reversa NO amplifica, només ens canvia, ens transforma, el ARN (si hi ha) per ADN. Recordatori, les PCRs (sí, son femenines, perquès són “reaccions”) són reaccions enzimàtiques en les que un enzim permet fer una còpia idèntica d’un fragment de doble cadena de ADN. Per tant en un cicle passaríem de 1 cadena a 2 cadenes, en el segon cicle de 2 cadenes a 4 cadenes, en el tercer cicle de 4 a 8 cadenes, i si vostès comencen a aplicar el concepte 2ⁿ on “n” és el numero de reaccions veuran que amb 10 cicles per exemple ja tindrien 1024 cadenes. La majoria de les reaccions d’amplificacions tenen entre 35 i 40 cicles. Recordin vostès, que el coronavirus, com molts altres virus respiratoris (el virus de la grip per exemple, però aquest està constituït per segments mentre que el coronavirus és una única cadena) és un virus ARN així, que pel que resta d’entrada, parlarem de RT-PCR, o més concretament de qRT-PCR, que, com hem dit abans seria Transcripció Reversa-Reacció en Cadena de la Polimerasa quantitativa. Aquesta reacció doble es pot fer tota ella en un sol tub, i ja va emprar-se en la pandèmia pel virus H1N1 l’any 2009, i el que cerca és amplificar milions de vegades un “petit fragment específic” del SARSCoV2; les “comentes” que acabo de posar tenen importància, les comentarem després.

Un resultat qRT-PCR positiu indica que el virus està present?

Home, si es fa una feina per no concloure això, no anem bé. Sí, un resultat RT-PCR positiu indica que el virus està present amb una molt alta probabilitat, el que no informa fefaentment és de l’estat (infecciós o no) d’aquest virus, només que el seu ARN estava a la mostra. Si una persona no mostra símptomes el que ens indica és que el virus està replicant-se i o bé esdevindrà simptomàtic o estem davant un pressimptomàtics que en 1 o 2 dies mostrarà simptomatologia. Si la persona mostra símptomes ens indiciarà que aquests són deguts, amb alta probabilitat, a SARSCoV2. L’ARN és una molècula que es degrada amb certa facilitat, si no està protegida; si detecten ARN en quantitats important això vol dir que està dins de embolcalls i càpsides víriques senceres, íntegres, que l’han estat protegint fins que nosaltres hem extret la mostra i hem trencat aquestes proteccions (tampons de lisi). I si no es detecta és que la persona no està infectada o ho està però en els dies inicials, quan el virus  acaba d’entrar i està iniciant la seva propagació, un període d’eclipsi. Res és tot o res, instantàniament, tampoc a la virologia.

Però se detecta solament el virus SARSCoV2? 

Està contestada parcialment  més amunt…sí, les RT-PCR emprades ara mateix són extremadament sensibles i eficients en la detecció de SARSCoV2, que no el virus CoVID19. N’hi ha diverses qRT-PCR que permeten amplificar-lo. I els encebadors (“primers”) i les sondes que s’ha dissenyat s’han fet a partir de seqüències presents en SARSCoV2 i no presents en altres coronavirus coneguts (que afecten a humans), o altres virus respiratoris com rinovirus, adenovirus, virus de la grip però també parainfluenzavirus o el virus respiratori sincitial, que no oblidem, poden també estar al nostre cos (a l’estiu amb alta improbabilitat, el mes de novembre o desembre amb una probabilitat molt més alta).

Els hi posaré un exemple. ….Imaginem uns encebadors de 15 nucleotids. Nucleòtids? Són les baules que permeten fer la cadena del ADN, de noms guanina (G), citosina ( C), timina (T) i adenina (A)). Aquests quatre nucleòtids s’endrecen en un ordre concret en aquesta mínicadena, mot curta, que ha de ser recíproc (complementari) al segment específic que hem escollit i que flanqueja la seqüència a amplificar. En certa manera, són les dents d’una cremallera, que “han de casar” amb l’altre banda, per permetre la reacció. Recordin, a més que això passa en dos punts de la cadena del genoma del virus, que potser disten 200 o 300 nucleotids (genoma del coronavirus? al voltant de 30.000 nucleotids). Això vol dir que tenim 15 posicions independents on pot ser que calgui A, o C, o G, o T, i a cada lloc la probabilitat és ¼. Per tant la probabilitat que la seqüència específica es torni a repetir en la natura, i recordem que ja hem cercat que no coincideixi amb moltes “coses víriques” conegudes, és de ¼ x ¼  x ¼ x ¼ x ¼ x ¼… i així fins a 15 cops. Facin servir la calculadora. I ara multipliquin per dos perquè això també ha de passar a l’altre costat. I ara sumin que la sonda fluorescent també s’uneix específicament entre els dos encebadors, però NO emetrà la seva senyal lluminosa fins que es connecti amb el segment amplificant-se, que és el que realment detectem amb l’equip. Sí, detectem solament SARSCoV2.

I com sabem això? Perquè tota tècnica diagnòstica s’ha de validar. I que vol dir validar? Vol dir, entre altres coses, matrius diferents (saliva, esput, mucositat nasals, etc.) inoculades amb el virus que ens interessa, SARSCoV2, o obtingudes d’un malalt, però també, en proves diferents, tots els altes virus esmentats i confirmar que tenim senyes positives pel primer i no per la resta. I confirmar que això passa amb operadors/treballadors diferents, en dies diferents amb sets de reactius diferents, en màquines diferents, fins i tot.

I si això no passa, si tenim senyals positives on no toca, o no tenim senyals positives consistents on toca, s’ajusten les condicions fins assolir-les. I això pot incloure quin és el millor tipus de mostra i com s’ha de conservar aquesta fins que és analitzada. Ens interessa la màxima especificitat sense perdre sensibilitat. I tot està en continua revisió, així que sí, detecten solament SARSCoV2.

Però el cultiu cel·lular és més «real», ens dona informació de virus infecciosos i no sols de genomes, oi?

Jo soc un fan del cultiu cel·lular; si es volen fer estudis de inactivació dels virus per desinfectants, o per agents físics com la temperatura o la radiació ultravioleta necessitem anar a cultius cel·lulars, que ens donaran, però, informació “in vitro”, en condicions controlades.

Però els cultius cel·lulars tenen inconvenients. És gairebé un art, una tècnica lenta (pots necessitar 1 o 2 o 3 setmanes per tenir un resultat), molt cara perquè requereix moltes hores de personal expert, i com dic amb cert art a les mans, i es veu afectat per les condicions d’emmagatzematge i la cadena de fred (vostè pot deixar una mostra a temperatura ambient o en refrigeració uns dies i trobarà senyal molecular; provi de fer el mateix i mirar d’aïllar el virus per cultiu cel·lular i fracassarà; és el que els vinc comentant, i els hi dic des de les espatlles de gegants, de la “escassa” persistència ambiental dels virus embolcallats). I per acabar-ho d’adobar és una tècnica menys sensible, que la PCR, qRT-PCR en el nostre cas.

Ep, que la RT-PCR també té el seu límit de detecció, eh? No pensem que una qRT-PCR pot detectar 1 sola còpia de ARN transcrita a ADN i multicopiada després. El que passa és que aquest límit és molt més baix que el del cultiu cel·lular.

Les dades de cultiu cel·lular es donen habitualment en TCID₅₀/mL; no explicarem ara com s’arriben a aquests valors però sí explicarem, perquè sí és l’objecte, com es donen molts cops els valors de qRT-PCR. Quan es té una corba patró, que relaciona Cts i concentració ARN per mL,  les dades es donen com a còpies ARN/mL però és molt freqüent al laboratori i als mitjans parlar de Ct (o les Cts en plural). Aquest valor marca UN cicle, EL cicle en el que la mostra ha arribat al llindar de positivitat. A partir d’aquell moment la mostra pot ser MÉS positiva, si volen, però en principi ja no serà negativa. Com més baix sigui el numero de cicle, indirectament ens dona una mesura de la concentració del ADN a amplificar; al nostre sistema li costa menys cicles en amplificar i donar senyal positiva. Dos mostres amb Cts de 20 i de 32 són dues mostres positives però una, la primera, molt més carregada de virus que la segona; hi ha 12 cicles de diferència; si multipliquen dos per 12 vegades tindran una estima de la diferència de concentració. Desconfiïn de Cts de 36, o 38, o 40; aquestes mostres són tan feblement positives, que probablement són negatives.

I un apunt final…hi ha moltes còpies defectives, no infeccioses, de virus voltant al costat de partícules infectives; el procés de multiplicació vírica no està, per res, exempt d’errades i de fet molts estudis per altres virus indiquen que el número de partícules no infeccioses és (molt) superior al de partícules infeccioses. Des d’aquest punt de vista, la qRT-PCR seria un surrogate, una aproximació perquè molt ARN d’aquestes partícules no infectives és encara amplificable.

Però és molt millor veure bé d’un ull i mig veure d’un altre que no veure-s’hi a dos pams. El primer escenari és el que permeten les tècniques diagnòstiques; el segon és no fer res.

Però aquesta, aquesta és una altra història.

Per cert, visitar l’entrada de la viquipedia, PCR a temps real, molt recomanable … https://ca.wikipedia.org/wiki/PCR_en_temps_real