comentarisviruslents

Aquest blog és una seguit de comentaris personals i probablement poc transferibles sobre ciència i política.

Archivos en la Categoría: parvovirus

Comentaris virus-lents (68): Inactivació vírica; el Sant Greal (3)?

Com dèiem a l’entrada prèvia comencem a desfilar el cabdell de mètodes d’inactivació vírica en hemoderivats i producte d’origen animal i comencem per uns mètodes històricament de llarg recorregut com són aquells que es basen en escalfar el material.

Escalfament de solucions aquoses. Un mètode típic és l’escalfament de solucions aquoses a 60 ºC durant 10 hores, la pasteurització, que és el tractament que s’utilitza en la farmacopea per a la inactivació viral en les preparacions d’albúmina. També, però, s’utilitza per a altres productes derivats del plasma: Factor de coagulació VIII (o FVIII) i antitrombina III. Desafortunadament, l’eficàcia d’aquest tractament és dependent de la presència d’estabilitzadors per tal de protegir les proteïnes i minimitzar la formació de neo-antigens, i aquests estabilitzadors també poden protegir de la inactivació els propis virus. Recordeu que els virus són en molt bona mesura proteïna (i àcid nucleic).

L’eficàcia de la pasteurització és diferent per a cada virus que es fa servir con a control. Així la pasteurització de concentrats d’antitrombina-III estabilitzats amb 0,5 M de citrat a pH 7,3 inactiven per complet (més de 6-log10) virus de la immunodeficiència humana (VIH) experimentalment inoculat, però també VHB. S’ha demostrat per diferents preparats, la inactivació completa de grans quantitats de virus embolcallats  (VIH, VHB, virus relacionats a VHC) i els virus no embolcallats (és a dir, petits virus como el poliovirus) en condicions de pasteurització clàssica. Estudis realitzats fa uns anys en el meu antic laboratori respecte l’eficàcia virucida de la pasteurització en productes intermedis en el procés d’obtenció d’hemoderivats demostraren que el VHA s’inactivava substancialment (reducció de més de 7-log10), encara que es va trobar HAV infecciós residual, al final del tractament tèrmic, fins i tot després de 10 hores, unes conclusions que no eren innovadores ja que altres autors les havien reportades.

Quan el material de partida te una provada termoestabilitat, es poden aplicar temperatures més altes. En el meu antic laboratori, es va realitzar una avaluació de l’eficiència de la inactivació viral del tractament tèrmic (87 a 93ºC) durant 180 minuts sobre una solució líquida d’origen animal. Aquest tractament resultà molt eficient (més de 4 log10R) per a la inactivació parvovirus porcí (PPV) i poliovirus (PV) a més d’alguns virus embolcallats.

Una de les preocupacions més importants dels mètodes de pasteurització és  aconseguir una bona barreja del líquid durant el tractament tèrmic per tal d’assegurar que tots els virus són sotmesos a la temperatura de processament el temps establert. S’han provat, en un estudi realitzat amb petits volums i temps de contacte curts, diferències en la inactivació de poliovirus en funció de la ubicació (vials parcialment submergits o submergits) i la agitació i el tipus d’agitació dels vials (rotatòria, per batzegades, en estàtic) que es troben dins el bany d’aigua. Per tant, de manera clara, el factor “barreja eficient” necessita ser estandarditzat.

Escalfament dels productes en pols. L’eficàcia d’aquest tractament pot variar d’acord a les condicions de liofilització, que és la manera habitual en la que s’obtenen alguns productes finals a partir de teixits animals, en particular els límits superior i inferior d’activitat d’aigua, que determinen la pressió de vapor parcial de l’aigua. La temperatura (60-80° C) i la durada (10-72 hores) del procés d’escalfament també són determinants.

Encara que alguns autors troben que la infectivitat del VHA és potencialment sensible a l’eliminació d’aigua, els resultats obtinguts per nosaltres mostraven que la caiguda de títol víric desprès de la liofilització per VHA estava entre 0,5-1,4 log10. No obstant això, altres virus semblants (virus no embolcallats de mida petita, com poliovirus) són més susceptibles, amb reduccions de títols entre 1,5-4,3 log10. Altres autors descriuen reduccions per liofilització de 1,5 log10 per PV i cap reducció per HAV, resultats que indirectament son reforçats per dades pròpies que demostren que la infectivitat de HAV no es veu molt minvada si es sotmès a dessecació a temperatures ambientals (reduccions entre 0,1-1,6 log10).

Quant a la pasteurització després d’una liofilització prèvia, no es detectà infectivitat residual de VHA després de 10 hores a 60 º C.

L’alta resistència a tractament tèrmic de parvovirus ha estat abastament descrita en diferents factors de coagulació. Tractaments tèrmics a 100ºC per 30 min va ser completament ineficaços per la inactivació de parvovirus B19, però, permetien la inactivació completa (per tant més d 4log10R) del VIH, el VHC i el VHA. Alguns estudis demostren que aquest efecte és molt ràpid; per VHA i poliovirus s’assoliren reduccions de 5 log10 un cop han passat tan sols 4 minuts d’escalfament. No obstant això, una vegada més, els procediments tèrmics poden fallar per inactivar completament parvovirus. L’eliminació dels parvovirus de productes sanguinis ha de cercar altres mètodes, ja sigui sols o en combinació amb la pasteurització.

Tractament amb calor seca. El factor de reducció general d’un procés de fabricació que inclogui una etapa de tractament de calor seca al final, comptarà amb un nivell de seguretat extra-viral proporcionada per aquest últim pas. Òbviament, el producte final ha de presentar una forta termoestabilitat. Aquest procediment s’ha assajat amb èxit per a la inactivació de HAV i el parvovirus caní (com a virus model) pels concentrats de factors de coagulació.

El resultats propis mostren que l’assecat a 70ºC en condicions de buit després d’ anhidrificació va ser eficient (més de 4 log10R) per a l’eliminació i / o inactivació de PV, i el virus de l’herpes simples (HSV), mentre PPV va mostrar un menor, encara que significatiu, grau d’inactivació, ja que menys del 0,1% de títol víric inicial sobrevisqué; per tant més del 99,9% s’inactivà.

 

El comportament de PV en aquests i altres experiments realitzats amb anterioritat fan despertar la preocupació d’estar-nos refiant massa de les dades obtingudes emprant aquest virus com a model. Degut a la seva escassa resistència, o alta sensibilitat, als tractaments, potser PV no ens estaria proporcionant una indicació adequada de la resistència d’altres virus humans (és a dir, HAV o parvovirus humà), en els productes derivats de plasma o en condicions de desinfecció o ambientals. La cerca d’un millor model, o assajos múltiples amb diferents virus per cobrir tots els aspectes de la resistència viral serien les possibles solucions.

 

Però aquesta, aquesta es una altra història.

Anuncios

Comentaris virus-lents (67): Inactivació vírica: el Sant Greal (2)?

Com deiem a l’entrada anterior, calia introduir a l’actor principal de la nostra obra, en aquest cas una obra coral, ja que d’autors, de virus, n’hi ha uns quants.

 

Els virus.

Els virus relacionats amb les malalties transmeses per la sang inclouen els següents gèneres:

  • Virus d’hepatitis A (VHA), inclòs en la família Picornaviridae, es transmet per via fecal-oral, però s’ha informat d’alguns casos de transmissió de VHA per productes de la sang (factors de coagulació). El VHA és altament resistent als tractaments fisicoquímics. Fins l’actualitat cap virus model satisfactori ha estat descrit per substituir-lo en les validacions encara que el virus de la encefalomiocarditis, abreujat EMCV, s’ha utilitzat de vegades.

blood hep-a5

Micrografía del virus de la hepatitis A

  • Virus de l’hepatitis B (VHB), inclòs en la família Hepadnaviridae, es transmet per la inoculació de sèrum contaminat durant transfusions de sang, la injecció de vacunes contaminades, o el tatuatge i, a més, pel contacte sexual. Com tots els virus amb embolcall, aquest virus és sensible a l’àcid, la pasteurització (recordem escalfar a 60ºC per 10 hores, hi ha variacions) o tractament amb solvent/detergent.
  • El virus de l’hepatitis C (VHC), inclòs en la família Flaviviridae, és sensible als mateixos tractaments emprats per a la destrucció VHB.
  • El virus de la immunodeficiència humana tipus 1 i 2 (VIH-1 i VIH-2), inclosos en el gènere Lentivirus, en la família Retroviridae. Els estudis realitzats pel que fa a la seva estabilitat als tractaments tèrmics, per exemple, demostren que és molt làbil.
  • Parvovirus B19 humà, inclosos en la família Parvoviridae, s’ha relacionat amb diverses condicions clíniques com eritema infecciós, artritis aguda, crisi aplàstica i anèmia transitòria prolongada en pacients immunocompromesos. Entre el 20 i el 50% de les infeccions per parvovirus són asimptomàtiques, per tant s’ha de considerar seriosament la probabilitat de transmissió del virus a receptors a partir dels donants de sang per a transfusió. Aquest virus és molt resistent als tractaments fisicoquímics i pot trobar-se present en els concentrats de factor de coagulació fabricats a partir de grans volums o pools de sèrum, per exemple. El parvovirus porcí (PVP) és un dels millors i més utilitzats model d’aquest parvovirus B19.

Blood Parvovirus_in_Blood

Micrografía del parvovirus B19

Els virus de la parainfluenza bovina (BPV), virus de la diarrea viral bovina (BVDV) i el virus de la pseudorrabia (PRV) s’han utilitzat àmpliament com a models per als virus embolcallats citats prèviament (VHB, VHC, VIHs). Cal tenir present, però, que poder treballar amb el virus potencialment “responsable” de la contaminació és l’ideal, però moltes vegades aquest virus no és cultivable o no permet treballar amb grans títols (grans quantitats) i per tant no podem reptar el nostre procés amb un allau de virus, no podem fer un “worst case”.

El procés d’inactivació; consideracions generals.

La inactivació de la infectivitat del virus sovint segueix a una corba bifàsica en què una fase inicial ràpida és seguida per una fase més lenta. És probable que els virus que escapen d’una primera etapa d’inactivació poden ser més resistents als passos o etapes subsegüents, sobre tot si aquestes ulteriors etapes d’inactivació comparteixen la nautra última (per exemple, si sotmetem al material a dues etapes d’inactivació tèrmica). Si la fracció resistent pren la forma d’agregats de virus, l’infectivitat romanent o residual pot ser altament resistent a una àmplia gamma de diferents tractaments químics i tèrmics.

Blood viral inactivation IgG

Tipica cinetica difàsica, de vegades funció d’altres paràmetres com la temperatura. Omar et al. Transfusion 36:866-872, 1996

El factor de reducció global per un procés donat de producció és el resultat de la suma dels factors de reducció individuals corresponents a cada etapa individual analitzada. És a dir, si tenim que una etapa tèrmica ens inactiva un virus 4 log10 (per tant ens permet passar de 100.000 virus inicials a 10 virus finals) i una ulterior etapa de nanofiltració te ella sola un potencial inactivador de 6 log10, el efecte conjunt de TOT el procés és de 10 log10, per tant potencialment podrien entrar 10.000.000.000 de partícules víriques a l’inici, que el procés les eliminaria/inactivaria totes.

Per garantir la seguretat viral dels productes d’origen animal, aquest factor de reducció general ha de ser substancialment més gran que els títols màxims del virus que podrien ocórrer en el material de partida emprat o que podria ser introduït de forma involuntària en excipients, conservants, estabilitzants, etc.

Ara que hem fet un repàs als virus potencialment presents als hemoderivats i hem fet algunes consideracions sobre el procés d’inactivació, a la propera entrada parlarem de mètodes d’inactivació tèrmica.

Perquè aquesta, aquesta és una altra història.