comentarisviruslents

Aquest blog és una seguit de comentaris personals i probablement poc transferibles sobre ciència i política.

Archivos en la Categoría: etapes inactivació

Comentaris virus-lents (67): Inactivació vírica: el Sant Greal (2)?

Com deiem a l’entrada anterior, calia introduir a l’actor principal de la nostra obra, en aquest cas una obra coral, ja que d’autors, de virus, n’hi ha uns quants.

 

Els virus.

Els virus relacionats amb les malalties transmeses per la sang inclouen els següents gèneres:

  • Virus d’hepatitis A (VHA), inclòs en la família Picornaviridae, es transmet per via fecal-oral, però s’ha informat d’alguns casos de transmissió de VHA per productes de la sang (factors de coagulació). El VHA és altament resistent als tractaments fisicoquímics. Fins l’actualitat cap virus model satisfactori ha estat descrit per substituir-lo en les validacions encara que el virus de la encefalomiocarditis, abreujat EMCV, s’ha utilitzat de vegades.

blood hep-a5

Micrografía del virus de la hepatitis A

  • Virus de l’hepatitis B (VHB), inclòs en la família Hepadnaviridae, es transmet per la inoculació de sèrum contaminat durant transfusions de sang, la injecció de vacunes contaminades, o el tatuatge i, a més, pel contacte sexual. Com tots els virus amb embolcall, aquest virus és sensible a l’àcid, la pasteurització (recordem escalfar a 60ºC per 10 hores, hi ha variacions) o tractament amb solvent/detergent.
  • El virus de l’hepatitis C (VHC), inclòs en la família Flaviviridae, és sensible als mateixos tractaments emprats per a la destrucció VHB.
  • El virus de la immunodeficiència humana tipus 1 i 2 (VIH-1 i VIH-2), inclosos en el gènere Lentivirus, en la família Retroviridae. Els estudis realitzats pel que fa a la seva estabilitat als tractaments tèrmics, per exemple, demostren que és molt làbil.
  • Parvovirus B19 humà, inclosos en la família Parvoviridae, s’ha relacionat amb diverses condicions clíniques com eritema infecciós, artritis aguda, crisi aplàstica i anèmia transitòria prolongada en pacients immunocompromesos. Entre el 20 i el 50% de les infeccions per parvovirus són asimptomàtiques, per tant s’ha de considerar seriosament la probabilitat de transmissió del virus a receptors a partir dels donants de sang per a transfusió. Aquest virus és molt resistent als tractaments fisicoquímics i pot trobar-se present en els concentrats de factor de coagulació fabricats a partir de grans volums o pools de sèrum, per exemple. El parvovirus porcí (PVP) és un dels millors i més utilitzats model d’aquest parvovirus B19.

Blood Parvovirus_in_Blood

Micrografía del parvovirus B19

Els virus de la parainfluenza bovina (BPV), virus de la diarrea viral bovina (BVDV) i el virus de la pseudorrabia (PRV) s’han utilitzat àmpliament com a models per als virus embolcallats citats prèviament (VHB, VHC, VIHs). Cal tenir present, però, que poder treballar amb el virus potencialment “responsable” de la contaminació és l’ideal, però moltes vegades aquest virus no és cultivable o no permet treballar amb grans títols (grans quantitats) i per tant no podem reptar el nostre procés amb un allau de virus, no podem fer un “worst case”.

El procés d’inactivació; consideracions generals.

La inactivació de la infectivitat del virus sovint segueix a una corba bifàsica en què una fase inicial ràpida és seguida per una fase més lenta. És probable que els virus que escapen d’una primera etapa d’inactivació poden ser més resistents als passos o etapes subsegüents, sobre tot si aquestes ulteriors etapes d’inactivació comparteixen la nautra última (per exemple, si sotmetem al material a dues etapes d’inactivació tèrmica). Si la fracció resistent pren la forma d’agregats de virus, l’infectivitat romanent o residual pot ser altament resistent a una àmplia gamma de diferents tractaments químics i tèrmics.

Blood viral inactivation IgG

Tipica cinetica difàsica, de vegades funció d’altres paràmetres com la temperatura. Omar et al. Transfusion 36:866-872, 1996

El factor de reducció global per un procés donat de producció és el resultat de la suma dels factors de reducció individuals corresponents a cada etapa individual analitzada. És a dir, si tenim que una etapa tèrmica ens inactiva un virus 4 log10 (per tant ens permet passar de 100.000 virus inicials a 10 virus finals) i una ulterior etapa de nanofiltració te ella sola un potencial inactivador de 6 log10, el efecte conjunt de TOT el procés és de 10 log10, per tant potencialment podrien entrar 10.000.000.000 de partícules víriques a l’inici, que el procés les eliminaria/inactivaria totes.

Per garantir la seguretat viral dels productes d’origen animal, aquest factor de reducció general ha de ser substancialment més gran que els títols màxims del virus que podrien ocórrer en el material de partida emprat o que podria ser introduït de forma involuntària en excipients, conservants, estabilitzants, etc.

Ara que hem fet un repàs als virus potencialment presents als hemoderivats i hem fet algunes consideracions sobre el procés d’inactivació, a la propera entrada parlarem de mètodes d’inactivació tèrmica.

Perquè aquesta, aquesta és una altra història.

Comentaris virus-lents (66): Inactivació vírica, el Sant Greal (1)?

Els virus són a tot arreu. Per tant, l’aparició del virus als aliments, derivats sanguinis, cosmètics o productes biològics i farmacèutics generats a partir d’animals, teixits o línies cel•lulars no ha de ser passada per alt. De fet, la contaminació viral pot sorgir per agents adventicis introduïts involuntàriament durant el procés de producció, també, a l’hora d’afegir excipients, o estabilitzants, o… Ja que és impossible garantir l’absència total de virus en els animals, éssers humans o línies cel•lulars que estan a la base dels processos, les etapes d’inactivació de virus han de ser inserides (incorporades si cal “ex professo”) en el normal desenvolupament dels processos de fabricació per tal de produir productes “lliures” (recordem el risc “0” no existeix) de virus. L’elecció de l’estratègia d’inactivació vírica serà diferent en funció de la seva naturalesa i composició química (la del virus que considerem que es pot trobar al material de partida) però també dependrà de les característiques d’aquest propi material de partida. La introducció d’aquests processos, que són un valor afegit per als productes industrials i biotecnològics, s’ha convertit en obligatòria (CPMP / BWP / 268/95; CPMP / BWP / 269/95) en l’àmbit de la Unió Europea (UE), particularment pel que fa a hemoderivats (concentrats d’immunoglobulines, factors de coagulació, etc.). En les següents entrades es discuteix l’eficàcia de diversos processos d’inactivació física (temperatura, dessecació, nanofiltració, alta pressió, radiació gamma) i químiques (digestions o pH) dels virus potencialment presents als hemoderivats.

Hi ha molts factors que poden afectar la seguretat viral dels productes biològics (productes derivats de la sang, en endavant hemoderivats, productes farmacèutics i cosmètics d’origen animal, etc). Per als productes derivats del plasma humà, virus que estableixen una virèmia com els virus de l’hepatitis A, B, i C (VHA, VHB, VHC, respectivament), els virus de la immunodeficiència humana 1 i 2 (VIH1 i 2), i parvovirus B19, tenen implicacions profundes en les infeccions transmeses per la sang i els seus productes.

blood hep-a5  Hepatitis A virus (micrografía electrònica)

Blood Parvovirus_in_BloodParvovirus B19 (micrografía electrònica)

 

Malgrat un sistema d’assegurament de la qualitat per a la recollida, l’escrutini de la idoneïtat dels donants, l’anàlisi de les donacions, la gestió de dades sobre l’epidemiologia de les infeccions transmeses per la sang o les dades del sistema d’informació després de la recollida de les donacions, és impossible garantir la seguretat viral TOTAL dels productes originats a partir de plasma, línia cel•lular, o teixits animals.

blood-blood-products-2-728

D’altra banda, en la fabricació de medicaments derivats del plasma humà, o concentrats de glòbuls sanguinis, altres factors entren en escena com per exemple:

  • la presència de contaminació microbiana pot conduir a l’acumulació de pirògens i,
  • la introducció de contaminants virals amb els reactius afegits en el procés de producció.

Davant aquesta situació es poden adoptar tres principals enfocaments, que són complementaris i no excloents, per controlar el potencial de contaminació viral dels productes biològics:

  • la selecció i l’assaig de la matèria primera per controlar l’absència de virus detectables,
  • l’avaluació de la capacitat dels processos de producció per eliminar / inactivar virus i,
  • controls sobre els productes finals i intermedis durant la producció per avaluar l’absència de virus detectables.

Cap enfocament per si sol ofereix un grau suficient de fiabilitat.

Hi ha infinitat de proves diagnòstiques que son capaces de detectar els virus (el seu genoma, o la seva càpside), però no hi ha una sola prova que permeti avaluar la presència de tots els virus coneguts. Dit d’una altra manera, per testar l’absència de tots els virus coneguts s’hauria de fer un nombre inversemblant de proves. I…, que en fem amb els virus desconeguts? Els virus coneguts ara, per exemple, no estaven descrits fa 40 anys.

A més, tots els sistemes de prova diagnòstica requereixen un nivell mínim de contaminació viral per registrar un positiu; per tant, s’han de considerar les variables estadístiques en el mostreig. Tenint clar que no podem analitzar-ho tot, s’ha de decidir, amb un criteri matemàtic o estadístic quin és el volum o quantitat de mostra que es considera representativa i que ens garantirà aïllar el virus en el cas que es trobi present.

La manera de superar tots aquests problemes és dur a terme, de forma concomitant, estudis de validació de la capacitat d’inactivació vírica d’una o diverses etapes en el procés de producció. Aquest enfocament permet establir si un procés de fabricació és capaç d’inactivar els virus amb l’eficiència requerida (normalment una reducció mínima de 4 log, que vol dir passar de 100.000 virus a “1” virus o bé de 10.000 virus a cap virus).

L’objectiu dels estudis de validació viral és:

  • proporcionar evidència certa que el procés de producció inactiva/elimina virus eficaçment,
  • proporcionar evidència indirecta que el procés de producció podria inactivar / eliminar “noves” o impredictibles contaminacions víriques per part de virus desconeguts.

Un altre tema important en l’avaluació de inactivació viral en els productes biològics és l’elecció dels virus que s’utilitzaran.

En qualsevol cas, els virus que seran objecte de validació han de ser escollits en primer lloc per la seva versemblança respecte el virus considerat possible contaminant del producte; per exemple, si sospitem que un producte pot contenir un virus de mida gran i amb embolcall lipídic potser farem servir un virus model com el Virus Vaccinia. En segon lloc si és factible s’escolliran diversos virus per cobrir una àmplia gamma de combinacions pel que fa a les característiques fisicoquímiques (virus embolcallats o no embolcallats, virus ARN o virus ADN, virus de mida petita o virus de mida gran) amb la finalitat d’avaluar la capacitat del procés per eliminar / eliminar virus “en general”.

Com la majoria dels estudis de validació empren soques de virus de laboratori, cal considerar que les soques de laboratori difereixen les uns de les altres i totes elles dels virus “silvestres”, presents al medi ambient (nosaltres també som medi ambient, pels virus). L’elecció del virus cal realitzar-la acuradament: quan dos virus similars podrien ser utilitzats per a estudis de validació, s’ha d’escollir sempre el més resistent ja que cerquem un pitjor cas, un “worst case”, cal anar en contra nostra per reptar més el procediment d’inactivació.

A la propera entrada parlarem dels virus que es fan servir en aquestes proves de validació.

Perquè aquesta, aquesta és una altra historia.

Comentaris virus-lents (40): Chikungunya al Carib; tu veuràs, Curro!

Al desembre de 2013, es va detectar el primer cas de transmissió local de Chikungunya a les Amèriques a Sant Martí. A finals d’any, s’havia estès a Martinica i Guadalupe, amb casos sospitosos a Sant Bartolomé. A finals de gener de 2014, els casos havien estat confirmats a San Bartolomé, així com les Illes Verges Britàniques, Dominica i Guyana Francesa. A finals d’abril, catorze països del Carib havien confirmat almenys un cas. Sobre la base de 4.000 casos confirmats i més de 30.000 casos sospitosos, l’Agència de Salut Pública del Carib (CARPHA) declarat en tot el Carib l’epidèmia del virus a principis de maig. A finals de maig, quatre casos de Chikungunya s’havien confirmat a la Florida. De fet fa unes poques setmanes es va descriure ja la transmissió autòctona del virus als EEUU ja que gent que no havia viatjat al Carib va contreure la malaltia, suposadament per picada de mosquit a sol americà. Aquesta transmissió autòctona va anar precedida d’un increment de casos de Chikungunya en turistes americans de tornada del Carib (58 casos en els primers sis mesos de 2014 respecte una mitjana en anys precedents de 28 afectats).

El país més afectat amb diferencia és la República Dominicana, i en segon lloc la veïna Haití. Ha resultat ser el virus més agressiu des de 2004, superar els brots de grip i el degoteig continu de casos de dengue, endèmic a la illa, el VIH, el virus del papil·loma humà, la ràbia, la poliomielitis, el xarampió i la rubèola, i la malària causada por un paràsit. Tanmateix, i malgrat la seva agressivitat, i que els malalts no tractats a temps de certes poblacions de risc poden morir, la mort per virus chikungunya registra la taxa més baixa, amb un 0,4% de letalitat. Però des que «oficialment» va aparèixer per primera vegada en la comunitat de Nigua, província Sant Cristòfol, els casos de chikungunya s’han disparat de tal manera que mantenen la població dominicana en una mena de temor o pànic generalitzat. Les autoritats sanitàries informen que en el que va d’any s’han detectat 165,433 casos de chikungunya (zero l’any 2013) contra 2,953 de dengue (més de 5000 el 2013 per les mateixes dates), que també és causada pel mosquit Aedes aegypti. Això dona idea de l’agressivitat amb què s’està expandint la malaltia. Les projeccions no alarmistes, conservadores, asseguren que almenys entre 5.0 i 7.0 milions de persones seran afectades, llavors és fàcil concloure que Chikungunya entrarà gairebé a totes les llars dominicanes. El Col·legi Mèdic Dominicà assegura que hi ha un enorme subregistre de la incidència a les xifres oficials, i fins i tot, i considerava conservadora una xifra «real» de 500.000 malalts (recordem que les oficials en el moment de la previsió del col·legi eren unes 170.000 afectats). En tan sols una setmana de juliol es van registrar 28.598 casos nous de chikungunya. Per posar en context en els ultims 10 anys els casos de dengue anuals han estat entre 9 mil i dotze mil; els casos de malària entre 2400 i 3800 afectats anuals; el HIV entre 3800 el 2005 als 570 el 2011. Xifres totes elles molt menors de les que presenta actualment Chikungunya.

No existeix vacuna per aquest virus, transmès per un mosquit i amb símptomes similars al dengue (mireu entrada 39). Durant el mes de juliol el virus arribà a Paraguai i Costa Rica, mentre que a Veneçuela  ja s’han registrat 12 casos. Puerto Rico també ha reportat desenes de casos locals no deguts a turistes retornats de zones afectades. Aquí un mapa, que ja estarà superat però és el més recent que he trobat, sobre els casos de transmissió autoctona, és a dir, on el cicle mosquit-humà ja és local, no degut a turistes.

 CHIK_Americas_Map-081214

La malaltia pel virus Chikungunya causa gran absentisme; en el sector industrial l’absentisme s’ha estimat en gairebé un 20% (o 55 hores per empleat afectat), segons dades de la patronal (Associació d’Indústries) amb un cost altíssim per aquest sector, ja que ha calgut pagar una quantitat molt elevada d’hores extra i contractar nous treballadors temporals en substitució dels tècnics o especialistes malalts el que ha portat a una disminució en el ritme de la producció.
Ja hem comentat la transmissió autòctona del virus als EEUU, particularment a Florida. No ha descobert la sopa d’all la European Center for Diseases and Control (ECDC) si avisa que la transmissió autòctona d’un cas de Chikungunya importat durant la temporada d’estiu a la UE és possible, sobre tot tenint en compte que el mosquit s’ha fet present a moltes contrades europees com es veu al següent mapa (mireu entrades 20 i 26).

Aedes albopictus in Europe

 

El risc estaria vinculat a la importació del virus pels pacients infectats en zones de vectors competents (com a conseqüència de la seva exposició a les espècies de mosquits que poden portar chikungunya: Aedes albopictus a l’Europa continental i l’Aedes aegypti a Madeira). La ECDC demana als viatgers que tornen de zones infectades que tinguin símptomes que cerquin atenció mèdica immediata i que apliquin mesures de protecció personal per evitar les picades de mosquits i donar base a una transmissió autòctona. Alhora ha reforçat els sistemes de vigilància i notificació ràpida dels casos. També s’ha avisat a les autoritats de seguretat de la sang de la UE pel que fa a la situació epidemiològica a les Amèriques en línia amb les mesures adoptades per a la infecció pel virus del Nil Occidental. Al tractar-se d’un virus que dona virèmia, en principi no és impossible que entri en alguna donació i pogués contaminar subministraments d’hemoderivats. Tanmateix, els que es coneix del virus Chikungunya apunta a que és inactivat fàcilment pels sistemes actualment emprats a l’industria de preparats sanguinis.

 

Sabíeu que quasi tots els hemoderivats que s’obtenen de les donacions son sotmesos a un o més processos d’inactivació vírica per incrementar la seguretat viral i que tot això arrencà com a resposta a la transmissió de virus com el viru de la imunodeficiència humana (HIV) el virus de la hepatitis C i parvovirus B19 en alguns concentrats de factors de coagulació i immunoglobulines allà per la dècada dels 80’s del segle passat. No? Doncs és un tema que dona per parlar abastament.

 

Però aquestes, aquestes seran altres històries.